王敦是东晋历史上唯一一个两次起兵作乱的权臣，桓温虽然也杀伐决断，操纵废立，毕竟也不敢像王敦那样公然起兵作乱。
晋元帝登基后，王敦便已经控制了整个长江中游地区，兵强马壮，加上他的妻子，又是晋武帝司马炎的女儿襄城公主，政治资本也很雄厚。所以，王敦根本不把晋元帝这个皇帝放在眼里。在他看来，元帝不过是自己和堂弟王导拥立的一个玩偶而已。因此，晋元帝登基后，王敦的不臣之心，愈发暴露出来，而且当时，朝中遍布王氏亲族，晋元帝的不安逐渐升级。
为了压制琅琊王氏的权势，不甘大权旁落的晋元帝，开始重用刘隗、刁协等人，抑制琅琊王氏。自从刘隗等人受到重用后，晋元帝对待王导的态度，明显疏远多了，但王导却很识大体，恪守了一个臣下的本分，《晋书·王导传》记载“有识咸称导善处兴废焉”。
太兴四年(321年)，晋元帝接受了刁协“以奴为兵，取将吏客使转运”的建议，部署军队，防备王敦，并且下诏，恢复扬州诸郡僮客的良民身份：
昔汉二祖及魏武皆免良人，武帝时，凉州覆败，诸为奴婢亦皆复籍，此累代成规也。其免中州良人遭难为扬州诸郡僮客者，以备征役。 (《晋书·元帝纪》)
与此同时，晋元帝又任命尚书戴渊为征西将军、都督司兖豫并冀雍六州诸军事、司州刺史，出镇合肥；丹阳尹刘隗为镇北将军、都督青徐幽平四州诸军事、青州刺史，出镇淮阴，名义上是要北伐后赵石虎，实际上则是要防范长江中游的王敦，是要借机夺了王敦的兵权。
谁曾想，元帝君臣此举，彻底激怒了本就心怀不轨的王敦，王敦觉得这对君臣实在是不识好歹。愤怒的王敦，做出了一个疯狂的决定：起兵！
永昌元年(322年)正月，王敦打出了诛杀刘隗“清君侧”的旗号，在武昌(今湖北鄂州)起兵，并还冠冕堂皇地上书晋元帝，罗列了刘隗的十大罪状，而且威胁晋元帝将刘隗斩首示众：“刘隗前在门下，邪佞谄媚，僭毁忠良，......愿陛下深垂省察，速斩隗首，则众望厌服，皇祚复隆。隗首朝悬，诸军夕退。”王敦的党羽沈充，起兵响应王敦，王敦大军直扑建康。
晋元帝得知王敦起兵作乱的消息后，勃然大怒，当即宣布王敦为叛逆，下诏要御驾亲征，与王敦决一死战：“......今亲率六军，以诛大逆，有杀敦者，封五千户侯。”同时，速召征西将军戴渊、镇北将军刘隗回京勤王，讨伐王敦。
然而，战局却出乎了晋元帝的意料，朝廷的正规军，完全抵挡不住王敦叛军凌厉的攻势，王敦一路打，晋军一路溃败，不久，王敦挥兵，攻破了建康的军事重镇石头城(位于今南京清凉山)。石头城一失，晋元帝彻底慌神了，在此情况下，贵为天子的他，被迫向王敦服软，元帝派遣使者，去见王敦，说自己愿意让出帝位：
公若不忘本朝，于此息兵，择天下尚可共安也。如其不然，朕当归于琅琊，以避贤路。 (《晋书.元帝纪》)
王敦拥兵占据石头城，却不到台城拜见晋元帝，反而放纵士兵，大肆劫掠，搞得建康城内人心涣散，城内的官员，四散逃命，最后只剩下两名侍中于左右护卫元帝。大势已去之下，晋元帝被迫向王敦求和。随后，晋元帝命文武公卿，前往石头城，拜见王敦，又大赦天下，宣布王敦无罪。
于是，王敦威逼朝廷加封自己为丞相、都督中外诸军事、录尚书事、江州牧，进爵武昌郡公，食邑万户。至此，王敦彻底掌控了东晋朝纲，晋元帝真正大权旁落。同年十一月，永昌元年(322年)十一月，晋元帝司马睿在忧愤中撒手西去，年仅47岁，这位东晋的第一位皇帝，在位六年，忧愤而终，太子司马绍即位，他就是东晋的第二位皇帝“晋明帝”。
在王敦举兵作乱的过程中，身为琅琊王氏精神支柱的王导，又是什么态度？是与堂兄王敦同流合污，还是坚守柱国大臣的节操。王导不愧是与谢安齐名的东晋中兴名相，在兄弟亲情和家国利益之间，王导选择了家国利益，他不能让琅琊王氏毁于一旦，为了家族，王导坚决站在了维护皇室正统的立场上，大义灭亲，与犯上作乱的堂兄王敦划清界限，坚决不与王敦同流合污。
王敦起兵作乱之时，刘隗曾力劝晋元帝，尽诛朝中王氏族人，王导对此忧惧不已，《晋书·王导传》记载“导率群从昆弟子侄二十余人，每旦诣台待罪”。王导带领着王氏一族中二十多名自己的兄弟子侄，来到台阁待罪，等候皇帝处置。
晋元帝与王导是什么关系？当然知道王导的为人，“帝以导忠节有素”，于是特地赐予了王导一套朝服，并且召见了他。王导见了元帝，连忙叩首谢罪：“逆臣贼子，何世无之，岂意今者近出臣族！”意思是哪朝哪代没有乱臣贼子，我没有想到如今居然出在我们家了。表明了自己与琅琊王氏和王敦誓不两立。晋元帝听后，如同吃了一颗定心丸，光着脚走上前去，拉住王导，对他说：“茂弘，方托百里之命于卿，是何言邪！”于是又下了一道诏令：